Técnicas no preparo de materiais para anatomia vegetal.

A anatomia vegetal é uma área do conhecimento que estuda a estrutura das diferentes células vegetais, o arranjo destas nos diversos tecidos e a organização dos tecidos nos órgãos das plantas (raiz, caule, folha, flor, fruto e semente) Desta forma, é essencial neste estudo a utilização de microscópio, uma vez que a maioria das estruturas apresenta tamanho reduzido. O avanço das técnicas e dos equipamentos de observação e a análise dos materiais têm auxiliado na resolução de problemas biológicos, tanto em nível microscópico (com a utilização de microscópio de luz) quanto submicroscópico (com a utilização de microscópios eletrônicos).

1. Microscopia de luz

A observação ao microscópio de luz exige que o material seja o mais transparente possível, para ser atravessado pela luz, o que implica em procedimentos de preparo do material para a produção de uma lâmina. Os materiais podem ser frescos ou fixados, dependendo do interesse do pesquisador.

O material fresco presta-se para observações rápidas ou que não dependem de conservação para a observação posterior.

Para se obterem camadas delgadas das amostras, o material pode ser seccionado à mão livre ou em micrótomo de mesa com auxílio de uma lâmina de aço descartável. Os cortes são montados em lâminas, utilizando-se água ou glicerina como meio de montagem, e cobertos com lamínulas; estas preparações são denominadas temporárias, pois após a observação, são descartadas.

A fixação é feita quando se pretende conservar o material por um maior tempo. Um bom fixador é aquele que conserva o máximo possível das características estruturais da célula no seu estado in vivo e altera o mínimo a sua constituição química. Existem várias misturas fixadoras, as quais são escolhidas conforme o objetivo do estudo, seguindo diferentes protocolos. Um dos fixadores mais utilizados é o FFA (formol, ácido acético e álcool, 5:5:90). Os materiais fixados podem ser cortados à mão livre, em micrótomo de mesa, micrótomo rotativo; neste caso, devem ser incluídos em parafina ou em resinas glicolmetacrilato.

A inclusão em parafina é feita com o intuito de se obterem fatias mais finas do tecido, o que garante melhor qualidade de imagem ao microscópio. Como a parafina não é miscível em água, nesse processamento exige que se proceda à desidratação da amostra. Pode-se utilizar para isso uma série etílica ou butílica crescente.  No caso da série etílica, é necessário utilizar o xilol como solvente orgânico, o qual é considerado uma droga muito tóxica e altamente cancerígena. Recentemente foram desenvolvidas resinas sintéticas (metacrilato) para inclusão de materiais. Essas são mais duras que a parafina, permitindo a obtenção de cortes mais finos; e menos tóxicas, porque dispensam o uso do xilol, por serem miscíveis em água.

Os cortes obtidos podem ser submetidos às diferentes técnicas de coloração, conforme o interesse do pesquisador. Como as células são constituídas basicamente pelos mesmos elementos químicos (hidrogênio, oxigênio, nitrogênio, carbono e fósforo), as estruturas celulares interagem de forma parecida com a luz, costumando-se proceder à coloração para aumentar o contraste entre as estruturas celulares. Existem diversos protocolos de procedimentos de coloração, entretanto o mais comum é a utilização de azul de Astra safranina ou verde rápido e safranina.

Para preparar uma lâmina permanente deve-se proceder à desidratação em série etílica, pois o meio de montagem que fica entre a lâmina e a lamínula é uma resina sintética (como o balsamo do Canadá, entelan, permout) que não é miscível em água.

2. Análise e interpretação do laminário

É difícil interpretar estruturas tridimensionais pelo estudo de cortes delgados que podem fornecer uma falsa impressão da arquitetura do órgão (Figura 01). Por exemplo, uma simples fatia de um objeto como o ovo poderá dar a determinada pessoa que nunca tenha visto este objeto interpretação errada de sua estrutura. Assim quando se estuda um órgão, é indispensável a utilização de cortes realizados em diferentes partes e em diferentes planos, ou então cortes seriados.

Quando a estrutura ou órgão apresenta formato laminar, achatado, os cortes podem ser:

Transversal: perpendicular ao maior eixo a estrutura ou órgão.

Longitudinal: é paralelo ao maior eixo da estrutura ou órgão.

Paradermico: é paralelo à superfície plana e ao maior eixo da estrutura ou órgão.

Em órgãos cilíndricos podem-se obter os seguintes tipos de cortes (Figura 03):

Transversal: perpendicular ao maior eixo a estrutura ou órgão.

Longitudinal Tangencial: paralelo ao maior eixo e não passa pelo centro.

Longitudinal Radial: paralelo ao maior eixo passando pelo centro.

3. Preparação microscópica

Para se confeccionar uma lâmina temporária é aconselhável seguir as orientações:

1. Colocar com um conta-gotas uma gota de água ou reagente sobre a lâmina de vidro;

2. Transferir para a lâmina, com auxílio de um pincel ou estilete, o corte a ser examinado;

3. Cobrir com lamínula: encoste um dos lados da lamínula no bordo da gota de líquido de inclusão e espere que este se espalhe ao longo da lamínula e então solte lentamente a lamínula para evitar a formação de bolhas;

4. Retirar o excesso de água ou reagente com papel filtro;

Uma boa lâmina é aquela que permite uma boa observação e deve apresentar as seguintes características:

·         Não ter bolhas de ar, pois se apresentam escuras ao microscópico;

·         Não conter excesso de material, o que dificulta a focalização;

·         A lamínula não deve flutuar, pois o excesso de líquidos serão retirados com papel filtro;

·         Nunca deve haver líquidos sob a mesa ou platina, pois dificulta o deslocamento da lâmina e danifica o microscópio.

Micrótomos para parafina e resina

Imagens de lâminas (com cortes e finalizadas)

4. Preparo de materiais para a microscopia eletrônica.

Os microscópios eletrônicos (de transmissão e de varredura) foram equipamentos que permitiram grandes avanços nos estudos biológicos, pois com eles foi possível visualizar e detalhar organelas e constituintes celulares, como membrana plasmática, núcleo, nucléolo, cromossomos, cloroplastos, mitocôndrias, plasmodesmos, retículo endoplasmático, ribossomos, microtúbulos, dentre outros. Entretanto, esses equipamentos impõem algumas limitações, principalmente pela necessidade de alto vácuo na coluna e pelo baixo poder de penetração dos feixes de elétrons. Assim, o exame de células ao microscópio eletrônico de transmissão só pode ser feito em fatias ultrafinas.  Já o microscópio eletrônico de varredura permite o exame de superfícies. Em ambos os casos, as amostras devem ser fixadas em fixadores com alta capacidade de penetração e terem boa habilidade de coagular proteínas. Todas as amostras devem ser desidratadas não existindo a possibilidade de estudar células vivas.

Referências:

AZEVEDO, A.A.; GOMIDE, C.J.; SILVA, E.A.M. Anatomia das espermatófitas: material de aulas práticas. 2º edição. Viçosa: UFV, 2003.