Citocininas: reguladores de divisão celular.

Descoberta, Identificação e Propriedades

Muitos estudos têm mostrado que as citocininas controlam vários aspectos do desenvolvimento vegetal, incluindo: divisão celular, retardamento da senescência de folhas, através da mobilização de nutrientes, dominância apical, quebra de dormência de gemas, desenvolvimento de flores, etc. 

Dentre estes, o controle da divisão celular é de considerável significância para o crescimento e desenvolvimento da planta e foi graças a este efeito que se identificou esta classe de fitohormônios. Nas décadas de 1940 e 1950, Folke Skoog testou muitas substâncias que tinham habilidade para iniciar e promover a proliferação de células de fumo em cultura de tecidos. Ele tinha observado que a adenina (base nitrogenada que participa da molécula de DNA) tinha um efeito promotor da divisão celular, o que o levou a testar a hipótese de que o DNA poderia estimular a divisão. Após um difícil e demorado fracionamento do DNA tratado com calor, Skoog e colaboradores identificaram uma pequena molécula que, na presença de auxinas, estimulava a proliferação de células em cultura de tecidos. Esta molécula foi denominada de cinetina, uma molécula derivada da adenina.

A cinetina não é um hormônio de plantas de ocorrência natural e, também, não é constituinte da molécula de DNA. 

No entanto, alguns anos após a descoberta da cinetina, pesquisadores demonstraram que extrato de endosperma imaturo de milho continha uma substância que causava os mesmos efeitos biológicos da cinetina. 

Esta molécula foi identificada como 6-(4-hidroxi-3metilbut-2-enilamino) purina, e recebeu o nome de Zeatina. 

A estrutura molecular da zeatina é similar à da cinetina. Ambas são derivadas da adenina (aminopurina). 

No entanto, elas possuem diferentes cadeias laterais que se encontram ligadas ao nitrogênio 6 da adenina. 

Devido a cadeia lateral da zeatina ter uma dupla ligação, ela pode existir nas configurações cis e trans. A zeatina natural, que ocorre nas plantas superiores, é a que apresenta configuração trans, embora as duas formas possuam atividade biológica. A atividade de uma isomerase tem sido demonstrada em tecidos de plantas, de modo que a cis-zeatina, quando aplicada a tecidos, pode ser convertida para a forma trans. Outras citocininas de ocorrência natural são a Dihidrozeatina e a Isopentenil Adenina. 

As citocinas naturais (zeatina, dihidrozeatina e isopentenil adenina) podem ser encontradas na forma livre, como ribosídeo (uma molécula de ribose ligada ao nitrogênio 9 da adenina), como ribotídeo (a ribose ligada ao N-9 é esterificada com ácido fosfórico) ou como glicosídeo (uma molécula de glicose é ligada ao N-7 ou N-9 da adenina ou ainda, ao oxigênio da zeatina ou dihidrozeatina). As citocininas são definidas como compostos que possuem atividades similares àquelas da trans-zeatina. 

Estas atividades incluem:

• Induzir a divisão celular em callus, na presença de auxinas; 

• Promover a formação de parte aérea ou raízes em cultura de tecidos, quando aplicada em proporção adequada com auxinas; 

• Retardar a senescência de folhas; 

• Promover a expansão de cotilédones em dicotiledôneas; Muitos compostos químicos têm sido sintetizados e testados em relação à sua capacidade de atuar como citocininas. 

Análises destes compostos permitiram estabelecer alguns requerimentos estruturais para a atividade. Em geral, todos os compostos ativos como citocininas possuem uma cadeia lateral ligada ao N-6 da adenina e todas as citocininas naturais são derivadas da adenina. As moléculas de cinetina e benziladenina (BA) são exemplos de citocininas sintéticas que possuem a cadeia lateral ligada ao N-6 da adenina (Figura 21). As únicas exceções a esta generalização são certos derivados da difeniluréia. Estes compostos possuem fraca atividade de citocininas e não possuem a cadeia lateral referida anteriormente. 

No curso da determinação do requerimento estrutural para a atividade de citocinina, os investigadores encontraram algumas moléculas que agiam como antagonistas da citocinina. 

Estes compostos resultam de modificações químicas no anel da purina e parecem bloquear a atividade de citocininas pela competição com o seu receptor. Este efeito pode ser sobrepujado pela adição de mais citocininas.

As cadeias laterais das citocininas naturais são quimicamente relacionadas com as estruturas de pigmentos carotenóides, dos hormônios giberelinas e ácido abscísico e de alguns compostos de defesa de plantas conhecidos como fitoalexinas. 

Todos esses compostos são formados, pelo menos em parte, através da junção de unidades de isopreno. A estrutura do isopreno é similar à da cadeia lateral da zeatina e de outras citocininas. Os precursores para a formação das unidades de isopreno são o ácido mevalônico ou o piruvato + 3-fosfoglicerato, dependendo da via envolvida. Estes precursores produzem a unidade biológica de isopreno, ou seja, o Isopentenil-Difosfato (IPP). Na primeira etapa da biossíntese de citocininas, uma enzima conhecida como transferase do isopentenil (IPT) catalisa a transferência do grupo isopentenil do IPP para o AMP, ADP E ATP. 

O produto da reação é o ribotídeo isopentenil adenina (a citocinina isopentenil adenina contendo uma ribose e um, dois ou três grupos fosfato). Este conjugado é, em seguida, convertido para trans-zeatina ou para outras citocininas naturais, dihidrozeatina e isopentenil adenina.

Transporte:

Os meristemas apicais das raízes são os principais sítios de síntese de citocininas livres na planta. As citocininas sintetizadas nas raízes parecem que são transportadas para a parte aérea via xilema. Algumas evidências confirmam este tipo de transporte: Quando a parte aérea é cortada próximo à superfície do solo, a seiva do xilema pode continuar fluindo na região do corte. Este exsudato do xilema contém citocininas; Se o solo é mantido úmido, o fluxo do xilema na região cortada pode continuar por alguns dias. Alguns resultados mostram que, mesmo nesse caso, o conteúdo de citocininas no exsudato não diminui, indicando que a mesma está sendo sintetizada nas raízes; Além disso, alguns fatores ambientais que afetam o funcionamento das raízes, como estresse hídrico e salino, reduzem o conteúdo de citocininas no exsudato do xilema. É necessário destacar, no entanto, que as citocininas não são sintetizadas exclusivamente nas raízes. Sementes em desenvolvimento e folhas jovens, também sintetizam citocininas. Porém, a produção de citocininas na parte aérea parece ser distribuída na própria parte aérea, via floema, enquanto a citocinina produzida nas raízes é distribuída para toda planta via xilema. Essas citocininas no exsudato do xilema estão principalmente na forma de ribosídeo de zeatina. 

Uma vez nas folhas, uma parte desses nucleosídeos é convertida para a forma livre (trans-zeatina) ou para a forma de glicosídeos. Muitas das diferentes formas químicas de citocininas são rapidamente interconvertidas pelos tecidos vegetais. As citocininas quando aplicadas na forma livre, podem ser convertidas para seus respectivos nucleotídeos ou glicosídeos e vice versa. Estas citocininas conjugadas podem ser consideradas formas de estoque de citocinina em um estado metabolicamente inativo. 

Por exemplo, em algumas sementes dormentes são encontrados altos níveis de glicosídeos (forma inativa) e baixos níveis de citocinina livre (forma ativa). De modo contrário, durante o processo de germinação dessas sementes, observa-se uma nítida queda nos níveis de glicosídeos e aumento nos níveis de citocininas livres. Assim, é possível que algumas glicosidases (enzimas) atuem na liberação de citocininas livres (como a transzeatina) a partir das citocininas conjugadas. 

Além da conjugação, as citocinas livres podem ser catabolisadas, produzindo compostos inativos. Em muitos tecidos de plantas, por exemplo, foi encontrada a enzima citocinina oxidase, a qual degrada zeatina, ribotídeo de zeatina e isopentenil adenina, produzindo adenina e seus derivados. 

Esta enzima inativa o hormônio e pode ser importante na regulação ou limitação dos efeitos das citocininas.

Papel Fisiológico

Os hormônios vegetais raramente, ou nunca, trabalham isoladamente. 

Mesmo nos casos em que a resposta se dá pela aplicação de um único hormônio, o tecido pode conter hormônios endógenos que contribuem para a resposta final. 

Em alguns casos a resposta está associada a dois ou mais hormônios, ou um hormônio pode induzir a síntese de um outro. Estas observações indicam que a resposta final está quase sempre associada ao Balanço Hormonal. Independente dessa visão, as citocininas podem estimular ou inibir uma variedade de processos fisiológicos e aspectos do desenvolvimento da planta. 

Muitos dos processos regulados pelas citocininas têm sido revelados em plantas transgênicas que superexpressam essa classe de hormônio. 

Estas plantas superprodutoras de citocininas exibem algumas características que indicam o papel executado pelas citocininas na fisiologia e no desenvolvimento da planta. 

Algumas características dessas plantas são:

• O meristema apical da parte aérea produz maior quantidade de folhas; 

• As folhas são mais ricas em clorofila e, como conseqüência, são mais verdes; 

• Retardamento da senescência; 

• Redução nítida na dominância apical; 

• Em casos extremos pode ocorrer encurtamento dos entrenós e redução na taxa de crescimento das raízes. 

A seguir serão descritos alguns papéis fisiológicos atribuídos, pelo menos em parte, às citocininas: 

a) A relação auxina/citocinina regula a morfogênese em cultura de tecidos 

De modo geral, na ausência de citocinina praticamente não se observa a ocorrência de divisão celular. 

Altos níveis de auxina em relação aos de citocinina promovem a formação de raízes, enquanto altos níveis de citocinina em relação aos de auxina estimulam a formação da parte aérea. 

Uma relação intermediária favorece o crescimento do tecido não diferenciado, comumente referido como callus. 

Muitos pesquisadores têm usado, também, a genética molecular para investigar o significado da relação auxina/citocinina na regulação da morfogênese. Eles utilizaram a bactéria Agrobacterium tumefasciens, a qual infecta os tecidos de plantas e provoca a formação de tumores. Os genes do plasmídio da bactéria foram, em seguida, incorporados ao genoma da célula hospedeira (da planta), produzindo novas células geneticamente modificadas (mutantes ou transgênicos). Nestes estudos, foram obtidos três mutantes: um mutante provocava a formação de tumores com anormal proliferação de raízes (tmr); outro provocava a formação de tumores com anormal proliferação de parte aérea (tms); e o terceiro provocava a formação de tumores não diferenciados, conhecidos como galhas (crown gall). 

No mutante tms foi observada a inativação de dois gens necessários para a biossíntese de AIA, o que proporcionou uma baixa relação auxina/citocinina e, como conseqüência, a anormal proliferação de parte aérea. No mutante tmr, ao contrário, encontrouse mutações no gen requerido para a biossíntese de zeatina. Este mutante, portanto, apresentou alta relação auxina/citocinina, o que justifica a anormal proliferação de raízes. O terceiro mutante super expressava a síntese de auxinas e de citocininas, o que justifica a formação de callus (neste caso, o ciclo celular é acelerado e nenhuma célula se diferencia). Estes resultados demonstraram a importância da relação auxina/citocinina na regulação da morfogênese. 

b) Citocinina e auxina regulam o ciclo celular em plantas

As citocininas foram descobertas devido à sua capacidade para estimular a divisão celular em tecidos supridos com um nível adequado de auxinas. Evidências experimentais sugerem que tanto a auxina como a citocinina participam na regulação do ciclo celular e elas atuam controlando a atividade de quinases dependentes de ciclina. As proteínas quinases dependentes de ciclina (CDKs) são enzimas que regulam o ciclo celular em eucariotos. A expressão do gen que codifica a principal CDK, a CDC2 (Cell Division Cycle, 2), é regulada pela auxina. No entanto, a CDK induzida pela auxina é enzimaticamente inativa e altos níveis dessa enzima não são suficientes para que ocorra a divisão celular. A citocinina parece ativar uma proteína ciclina tipo G1, a qual se liga à CDK e produz um complexo ativo (CDK-G1). A ativação da CDK, então, permite a realização do ciclo celular e, consequentemente, a divisão da célula. Em mutantes que super expressam a biossíntese de citocininas e de auxinas, o ciclo celular é acelerado e pode ocorrer a formação de callus. 

c) Quebra da dominância apical e indução do crescimento de gemas.

Na maioria das plantas superiores, o crescimento da gema apical inibe o crescimento das gemas laterais, um fenômeno conhecido como Dominância Apical. Plantas com forte dominância apical, tais como milho, têm um único eixo de crescimento com poucas ramificações laterais. Em contraste, muitas gemas laterais crescem em muitos arbustos. Embora a dominância apical possa ser determinada primariamente pelas auxinas, estudos fisiológicos indicam que citocininas executam um papel importante em iniciar o crescimento de gemas laterais. 

Por exemplo, aplicação direta de citocininas em gemas axilares de muitas espécies, estimula a divisão celular e o crescimento da gema. O fenótipo de mutantes superprodutores de citocininas é consistente com o papel desta classe de hormônios na dominância apical. Por exemplo, plantas de fumo e de Arabidopsis do tipo selvagem (não mutante) mostram forte dominância apical durante o crescimento, enquanto que nos mutantes superprodutores de citocininas as gemas laterais crescem vigorosamente e competem com o ápice da parte aérea por nutrientes. Consequentemente, as plantas mutantes mostram-se bastante ramificadas. 

Apesar desses estudos bastante esclarecedores, relacionados aos papéis das auxinas (ver auxinas) e das citocininas no controle da dominância apical, outros estudos ainda são necessários. Acredita-se que outros sinais, promotores ou inibidores, podem estar envolvidos no desenvolvimento das gemas laterais e, portanto, no controle da dominância apical. 

d) Retardamento da senescência de folhas e mobilização de nutrientes

Folhas destacadas de plantas lentamente perdem clorofila, RNA, lipídios e proteínas, mesmo que elas sejam mantidas úmidas e providas de nutrientes minerais. Estas mudanças também ocorrem normalmente nas folhas de plantas, constituindo-se na fase final da vida das folhas. Este processo de envelhecimento programado que leva à morte recebe o nome de senescência. Este processo parece estar sob o controle das citocininas. O tratamento de folhas isoladas de muitas espécies com citocininas retarda o processo de senescência. Este efeito pode ser marcante, particularmente quando a citocinina é aplicada diretamente sobre a planta intacta. Os efeitos podem também ser localizado dentro de uma mesma folha, se a aplicação for feita de forma localizada (aplicando-se citocinina apenas em uma das metades da folha, observa-se o retardamento da senescência somente na região tratada). Embora evidências sugiram que folhas jovens podem produzir citocininas, as folhas maduras não podem. As folhas maduras dependem da citocinina proveniente das raízes, via xilema. A produção de citocininas nas raízes e o seu transporte para a parte aérea podem ser influenciados por fatores ambientais e pelo próprio estádio de desenvolvimento da planta. Por exemplo, estresses hídrico e salino afetam a produção de citocininas nas raízes e aceleram a senescência de folhas. Já em folhas de soja, a senescência é iniciada pela maturação da semente, um fenômeno conhecido como Senescência Monocárpica. Esta senescência pode ser retardada pela remoção da semente no início do seu desenvolvimento. Neste caso, a retirada da semente controla o transporte de citocininas das raízes para as folhas. As citocininas envolvidas no retardamento da senescência são primariamente os ribosídios de zeatina e de dihidrozeatina, os quais são transportados das raízes para as folhas pela corrente transpiratória (via xilema). Nas folhas, essas formas conjugadas são convertidas para as formas livres, que são ativas. As evidências mais convincentes sobre os papéis das citocininas no controle da senescência têm sido obtidas com a utilização de transgênicos. Por exemplo, a senescência de folhas é retardada em plantas transgênicas de fumo que possuem um gen que controla a biossíntese de citocininas.

O mecanismo pelo qual as citocininas são capazes de retardar a senescência não é claro, porém, algumas evidências indicam que as citocininas exercem importante papel na mobilização de nutrientes. As citocininas influenciam o movimento de nutrientes (orgânicos e inorgânicos) de outras partes da planta para as folhas, um fenômeno conhecido como mobilização de nutrientes induzido pelas citocininas. 

A participação das citocininas na mobilização de nutrientes tem sido revelada quando nutrientes marcados radioativamente são fornecidos às plantas, após o tratamento de uma folha ou parte dela com citocininas. As plantas são, posteriormente, autorradiografadas para verificar a mobilização dos nutrientes. Os resultados destes estudos mostram que os nutrientes são preferencialmente transportados para os tecidos tratados com citocininas, onde eles se acumulam. 

e) Maturação de cloroplastos 

Embora a maioria das sementes de plantas possam germinar no escuro, a morfologia das plântulas crescendo no escuro é muito diferente daquelas que crescem na luz. As plantas no escuro são estioladas, tendo hipocótilo e entrenós alongados, cotilédones e folhas não expandidos, e cloroplastos não maturos. Ao invés de maturar como cloroplastos, os proplastídios de plântulas crescendo no escuro desenvolvem-se em etioplastos. Nos etioplastos, a membrana interna forma um treliça compacta e altamente regular, conhecido como corpo prolamelar. Os etioplastos também possuem alguns carotenóides, sendo esta a razão para a coloração amarelada das plantas estioladas. Porém, os etioplastos não possuem clorofila nem as enzimas e as proteínas estruturais requeridas para a formação da maquinaria fotossintética. Quando as plantas germinam na luz, os cloroplastos maturam diretamente dos proplastídios presentes no embrião, porém, etioplastos podem também gerar cloroplastos quando as plantas estiolados são iluminadas. Quando as folhas estioladas são tratadas com citocininas, antes de serem iluminadas, elas formam cloroplastos com extenso sistema de membrana interna e com maiores taxas de biossíntese de clorofila e de enzimas fotossintéticas. Também, plântulas de Arabidopsis (não mutantes) germinando no escuro e na presença de citocininas, desenvolvem características de plântulas que germinam na luz.

As características das plantas tratadas com citocininas: 

• Encurtamento do caule; 

• Expansão dos cotilédones; 

• Iniciação de folhas no meristema apical; 

• E, também, se observa parcial desenvolvimento dos cloroplastos, incluindo a síntese de algumas enzimas da fotossíntese. Estes resultados indicam que as citocininas participam da regulação da síntese de pigmentos e de proteínas associadas com o processo fotossintético, juntamente com outros fatores ambientais, tais como luz e nutrição. 

f) Outros efeitos relacionados às citocininas

 As citocininas podem promover ou inibir a expansão celular. A promoção da expansão celular pelas citocininas é mais claramente demonstrada nos cotilédones de algumas dicotiledôneas que possuem folhas cotiledonares. De modo contrário, as citocininas podem inibir o alongamento celular em caules e raízes. Neste caso, é provável que a inibição do alongamento do caule pelas citocininas, esteja associada à produção do hormônio gasoso etileno.  

Referências:

FERRI, M.G. Fisiologia Vegetal. Volume II. São Paulo: EDUSP, 1979.
RAVEN, P.H.; EVERT, R.F.; EICHHORN, S.E. Biologia Vegetal. Rio de Janeiro: Guanabara-Koogan, 6º ed. 2001.
TAIZ, L; ZEIGER, E. Fisiologia Vegetal. 3º edição. Artmed, 2003.

http://www.fisiologiavegetal.ufc.br/APOSTILA/REGULADORES.pdf